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| G5U HiFi DNA Polymerase（G5U高保真聚合酶）， 由HaiGene分子酶進(jìn)化平臺(tái)（in silico Design & invitro Evolution Workflow）篩選獲得，其融合Q5和Q5U的性能于一身，使其成為一酶多用的全能選手。該酶來源于高保真DNA聚合酶，并加入了增強(qiáng)的延伸結(jié)構(gòu)，使其具有長片段擴(kuò)增、高產(chǎn)能力。強(qiáng)壓力篩選的外切活性區(qū)域（280xTaq酶保真度），使其具有超保真性能（與Q5同水平）。底物活性中心的改造，使其具有dUTP滲入的能力、擴(kuò)增含有尿嘧啶模板的能力。使用該酶可輕松擴(kuò)增8kb的基因組DNA、20kb的λDNA。該酶具有2kb/min以上的延伸速度。該酶具有5’-3’的聚合酶活性、強(qiáng)3’-5’的外切酶活性，產(chǎn)物為平末端。 許多有高保真功能的聚合酶來為 B型 DNA 聚合酶，在遇到 DNA 模板中的尿嘧啶堿基時(shí)停止復(fù)制。 G5U高保真聚合酶刪除了尿嘧啶結(jié)合域，使其能夠讀取和擴(kuò)增含有尿嘧啶的模板，該性能賦予其獨(dú)特的“U” 特征。該特征有兩個(gè)重要的應(yīng)用方向：（1）用于超保真擴(kuò)增重亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化、脫氨基、或受損DNA；（2）在超保真擴(kuò)增中搭配dUTP和熱敏UDG，用于防止PCR體系中攜帶污染。除此外，也多用于USER 克隆。 5xG5U HiFi PCR Mix包含藍(lán)色電泳指示染料，并且采用了Mg2+封閉的熱啟動(dòng)方式，以獲得最高特異性的擴(kuò)增。當(dāng)Blocker加入到反應(yīng)體系時(shí)，Blocker與Mg2+形成不溶沉淀物，聚合酶活性被完全阻斷，在95℃加熱2min后，Activator水解掉Blocker，Mg2+得以釋放,從而啟動(dòng)擴(kuò)增反應(yīng)。
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主要特征 |
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單位定義 |
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| 一個(gè)活力單位即在72°C條件下，30分鐘內(nèi)催化10 nmol dNTP的摻入反應(yīng)成為酸不溶性物質(zhì)所需的酶量。 | |||||||||||||||||||||
儲(chǔ)存 |
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| （1）酶儲(chǔ)存液：10mM Tris-HCl，pH7.6，100mM NaCl，0.05% Tween20, 1mM DTT，0.5mM EDTA，50%甘油。 （2）置于-20°C以下，可保存3年。 |
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功能性測(cè)試（該數(shù)據(jù)來自HaiGene實(shí)驗(yàn)室，未經(jīng)允許不得轉(zhuǎn)載！） |
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| 1.不同長度片段的擴(kuò)增圖（最高到20kb） | |||||||||||||||||||||
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| Fig1：使用G5U HiFi DNA Polymerase以gDNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增500bp-8kb的產(chǎn)物，以λDNA為模板擴(kuò)增15-20kb的產(chǎn)物。酶的使用濃度為：0.02-0.04U/μl。 | |||||||||||||||||||||
| 2.不同酶量的擴(kuò)增性能 | |||||||||||||||||||||
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| Fig2：以λDNA為模板（40pg/μl）分別使用不同量的G5U擴(kuò)增1kb的片段，如圖所示在0.01U/μl的酶濃度下即可有效擴(kuò)增。（左圖） 以gDNA為模板（2ng/μl）分別使用不同量的G5U擴(kuò)增5kb的片段，如圖所示在0.02U/μl的酶濃度下即可有效擴(kuò)增。（右圖） | |||||||||||||||||||||
| 3.模板擴(kuò)增靈敏度展示 | |||||||||||||||||||||
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| Fig3：使用G5U HiFi DNA Polymerase以不同量的gDNA為模板擴(kuò)增500bp的產(chǎn)物，如圖所示該酶可擴(kuò)增低至10pg的gDNA（約3-5個(gè)細(xì)胞），酶工作濃度為0.04U/μl。 | |||||||||||||||||||||
| 4.高GC含量模板的擴(kuò)增 | |||||||||||||||||||||
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| Fig4：使用G5U HiFi DNA Polymerase以人基因組DNA為模板擴(kuò)增1250bp 的高GC（67%）片段，在1xQ Solution的條件下，可擴(kuò)增低 至2ng的模板，酶的工作濃度為0.02U/μl。 | |||||||||||||||||||||
| 5.擴(kuò)增dUTP模板性能 | |||||||||||||||||||||
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| Fig5：G重硫酸鹽處理DNA后，未發(fā)生甲基化的C堿基轉(zhuǎn)化為U堿基，使用G5U HiFi DNA Polymerase用于高保真擴(kuò)增DNA甲基化實(shí)驗(yàn)，擴(kuò)增產(chǎn)物為500bp，酶的工作濃度為0.04U/μl。 | |||||||||||||||||||||
| 6.保真度 | |||||||||||||||||||||
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| Fig6：使用G5U HiFi DNA Polymerase對(duì)模板DNA進(jìn)行35輪PCR擴(kuò)增后,對(duì)PCR進(jìn)行NGS測(cè)序。結(jié)果表明G5U與Q5 DNA聚合酶保真度相當(dāng)。 | |||||||||||||||||||||
