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| 基于自身分子酶進化技術平臺（In silico Design & in vitro Evolution Workflow），并持續聚焦LAMP恒溫擴增技術，HaiGene全新升級的Bst4.2系列，將LAMP擴增技術推入了新的高度。熱啟動Bst4.2系列在保持Bst4.0 通擴的能力的基礎上，全系包含熱啟動Aptamer，該配體確保酶在<30℃時，酶活封閉效率>95%,在>60℃時1min內酶活完全釋放。現階段，熱啟動HotStart Bst4.2 Polymerase為已知的LAMP擴增最佳用酶，與普通LAMP擴增體系相比它有絕對的優勢。 | ||||||||||||
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實例性能展示 |
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| 1、Bst 4.2熱啟動性能展示 采用熒光酶活測定法在30℃和60℃條件下測定HotStart Bst 4.2，結果顯示與未加入Aptamer的對照比較來看。HotStart Bst 4.2在30℃條件下酶活幾乎無活性，而60℃條件下1min內酶活完全釋放，恢復100%活性。 |
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| 2、以Bst 4.2 SYBR Green試劑進行標準LAMP和eLAMP擴增比較 以human Total RNA為模板，采用RnaseP LAMP Primer進行標準LAMP和eLAMP 擴增。在25ul擴增體系中加入10ng、1ng和0ng的RNA，70℃反應40min。從擴增結果可獲得，在Helicaser的加持下F3/B3可完全去除，對擴增速度幾乎無影響，并且非特異性擴增得到改善。 6 Primer LAMP引物濃度：FIP/BIP=0.8 μM; LoopF/B=0.4 μM; F3/B3=0.1 μM。 4 Primer eLAMP引物濃度：FIP/BIP=0.8 μM; LoopF/B=0.4 μM。 |
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| 3、以Bst 4.2 Basic試劑進行DP-eLAMP探針法擴增 在眾多的探針法LAMP測試中，DP-LAMP探針法(Displaceable Probe LAMP)為HaiGene推薦的使用方法（參考PMID: 33626039）。在LAMP擴增中將LF或LB引物退火至互補的猝滅oligo，利用鏈置換活性獲得游離的熒光信號（可參考HaiGene A3831-21說明書資料）。該方案可進一步降低LAMP的非特異擴增。下圖為DP-eLAMP進行三種熒光標記探針的實驗數據。結果顯示HotStart Bst4.2總能獲得高特異性和高重復性的擴增。 |
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| 4、以Bst4.2 L-HNB 試劑進行L-HNB (紫羅蘭-淡綠) 變色反應（肉眼觀察） 以2019-nCoV體外轉錄RNA為模板，采用eLAMP擴增法（FIP/BIP=0.8 μM; LoopF/B=0.4 μM）, 對10000、1000、100、25copies/管的陽性RNA進行檢測，ddH20為陰性對照（4重復）。下圖為70℃反應30min 后的檢測結果。結果表明L-HNB法獲得清晰易于區分的顏色變化，極易區分陽性和陰性擴增。 |
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| 5、 以Bst4.2 L-HNB (紫羅蘭-淡綠) 變色反應對反應緩沖鹽Tris的耐受性測試 以2019-nCoV體外轉錄RNA為模板，采用eLAMP擴增法（FIP/BIP=0.8 μM; LoopF/B=0.4 μM）, 對1000copies/管的陽性RNA進行檢測（2重復），ddH20為陰性對照（2重復）。下圖為70℃反應30min 后的檢測結果。結果表明L-HNB法，在1x濃度下可耐受10mM Tris-HCl的緩沖鹽，陽性樣本仍然可以充分的變色。該變色方法不受樣本中緩沖鹽影響。 |
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| 6、 以Bst4.2 Red試劑進行LAMP紅黃變色擴增 以2019-nCoV體外轉錄RNA為模板，1-6分別為1、10、100、1000、104和106Copy，NTC為ddH2O為模板。上圖為加樣結束反應起始前，下圖為70℃反應30min后。 |
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| 7、 以Bst 4.2 Basic試劑搭配 OG 橙綠變色反應管（A3821） 以2019-nCoV體外轉錄RNA為模板，1-6分別為1、10、100、1000、104和106Copy，NTC為ddH2O為模板。上圖為加樣結束反應起始前，下圖為70℃反應30min后。 |
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